상추의 Bitter Sesquiterpene Lactones에 관한 연구

Ⅲ. 材料 및 方法

3.1. Bitter sesquiterpene lactones(BSL) 추출과 정성 및 정량분석

3.1.1. 시험 재료 및 추출방법

상추의 쓴맛을 내는 bitter sesquiterpene lactones의 주요 화합물은 lactucin, 8-deoxylactucin과 lactucopicrin이다 (Fig. 3.1).

이 물질들을 분리 동정하여 BSL 표준물질을 얻고자 BSL 함량이 상추보다 상대적으로 높아 추출실험이 용이한 치커리 'Radicchio' (Cichorium intybus L.)를 경기도농업기술원 유리온실에서 수경재배하여 이용하였다.

Fig. 3.1. The structures of several BSL (Lactucin C₁₅H₁₆O₅, MW : 276.3, 8-deoxylactucin C₁₅H₁₆O₄, MW : 260.3, lactucopicrin C₂₃H₂₂O₇, MW : 410, De Kraker et al., 1998; Martha, 1983).

추출방법은 치커리 'Radicchio' 잎을 채취하여 생체로 녹즙기를 이용하여 마쇄한 후 그 수용액을 모은 다음, 수용액을 rotary evaporator로 40∼50℃에서 1∼5 mmHg에서 감압 증류하였다. 수용액을 감압 증류하고 남은 잔사를 메탄올에 넣고 1시간 동안 환류시켰다.

메탄올 용액을 상온으로 냉각시킨 후 여과지를 이용하여 여과하고 여과된 용액은 rotary evaporator로 30∼35℃를 유지하며 1∼5 mmHg의 압력상태에서 감압 증류하였다. 메탄올 용액을 감압 증류하고 남은 잔사를 물에 녹여서 ethyl acetate로 2∼3회 추출하였다. Ethyl acetate 추출 용액을 황산마그네슘(MgSO₄)으로 탈수한 다음 rotary evaporator로 1∼5 mmHg에서 감압 증류한다. 이때 rotary evaporator의 온도는 20∼30℃를 유지하였다. 감압 증류하고 남은 잔사를 MeOH/CHCl₃(v/v=1/2) 용액에 녹여서 HPLC로 분리하였으며 HPLC 조건은 Table 2.1과 같았다.

이 추출방법은 Price 등(1990)의 방법을 변형한 것이다.

Table 2.1. Instrument and condition for identification and quantification of bitter sesquiterpene lactones in HPLC analysis.

Instrument
Column

Mobile phase
Retention time
Flow rate
Detector

Hewlett Packard, HP 1100 Series
HP XDB-C18, 4.6×150mm, 5u, spherisorb OSD2 (5 ㎛)column (250×4.6 mm)
H₂O/acetonitrile (90/10 = v/v) to 58/42 = v/v
30 min.
1 mL·min^-1
256 nm

Table 2.1. Instrument and condition for identification and quantification of bitter sesquiterpene lactones in HPLC analysis.
Instrument Column Mobile phase Retention time Flow rate Detector	Hewlett Packard, HP 1100 Series HP XDB-C18, 4.6×150mm, 5u, spherisorb OSD2 (5 ㎛)column (250×4.6 mm) H₂O/acetonitrile (90/10 = v/v) to 58/42 = v/v 30 min. 1 mL·min^-1 256 nm

3.1.2. Bitter sesquiterpene lactones의 정성 및 정량분석

치커리 'Radicchio' 잎에서 추출한 추출액에서 lactucin, 8-deoxylactucin과 lactucopicrin의 정성분석을 위해 화합물 내에 있는 수소원자의 개수 및 화합물의 구조를 유추하기 위해 NMR (Bruker, Avance DRX-600) 을 이용하여 proton spectrum을 얻었으며, 각 화합물의 분자량을 확인하기 위해 LC mass (QUATTRO LC, Triple Quadrupole Tandem Mass Spectrometer) 분석을 실시하였는데, 실험과정에서 물질 분리에는 HPLC를 이용하였다.

추출된 시료의 농도를 결정하기 위해 BSL과 거의 같은 구조를 갖고 있는 santonin (C₁₅H₁₈O₃, MW : 246.29) 을 표준물질로 하여 19 ppm과 104.4 ppm의 농도에서 HPLC로 정량 하였으며 조건은 Table 2.1과 같다.

3.2. 품종별 bitter sesquiterpene lactones 함량변화

3.2.1. 시험 재료 및 방법

상추 품종별 BSL 함량을 알아보고자 채취한 상추는 경기도농업기술원 (경기, 화성) 내에 설치된 유리온실 안에 설치된 담액수경재배 시스템 시설에 Table 3.1에 나타낸 '강한청치마' 등 10품종을, 2001년 6월 8일 우레탄스펀지에 파종하여 3주간 양액육묘 후 6월 29일 본포에 정식하여 담액수경 재배하였다.

Table 3.1. The characteristic of different leafy lettuce cultivars cultivated in hydroponics.

Variety

Leaf color

General type

Ganghancheongchima (강한청치마)

Green

Cutleaf lettuce

Cheonghacheongchima (청하청치마)

Green

Cutleaf lettuce

Hanbatcheongchima (한밭청치마)

Green

Cutleaf lettuce

Hajicheongchukmyeon (하지청축면)

Green

Cutleaf lettuce

Daetongyeoleumjeokchukmyeon (대통여름적축면)

Red

Curled lettuce

Seonpungpochapjeokchukmyeon (선풍포찹적축면)

Red

Curled lettuce

Taepungyeoleumjeokchukmyeon (태풍여름적축면)

Red

Curled lettuce

Yeonsanhongjeokchukmyeon (연산홍적축면)

Red

Curled lettuce

Waolhajeokchukmyeon (월하적축면)

Red

Curled lettuce

Bulkkotchukmyun (불꽃축면)

Red

Curled lettuce

Variety	Leaf color	General type
Ganghancheongchima (강한청치마)	Green	Cutleaf lettuce
Cheonghacheongchima (청하청치마)	Green	Cutleaf lettuce
Hanbatcheongchima (한밭청치마)	Green	Cutleaf lettuce
Hajicheongchukmyeon (하지청축면)	Green	Cutleaf lettuce
Daetongyeoleumjeokchukmyeon (대통여름적축면)	Red	Curled lettuce
Seonpungpochapjeokchukmyeon (선풍포찹적축면)	Red	Curled lettuce
Taepungyeoleumjeokchukmyeon (태풍여름적축면)	Red	Curled lettuce
Yeonsanhongjeokchukmyeon (연산홍적축면)	Red	Curled lettuce
Waolhajeokchukmyeon (월하적축면)	Red	Curled lettuce
Bulkkotchukmyun (불꽃축면)	Red	Curled lettuce

시험에 이용된 양액은 Yamazaki 상추 전용액으로, 다량원소는 NO₃-N 6, NH₄-N 0.5, PO₄-P 0.5, K 4, Ca 1, Mg 0.5, SO₄-S 0.5 mM 농도로 하였고, 미량원소는 각 처리 공히 Fe 35, B 18, Mn 3.6, Zn 0.3, Cu 0.2, Mo 0.1 μM로 하였다. 또, 시험에 사용된 배양액 원수의 무기성분 함량은 Table 3.2와 같았고 미량원소 함량은 무시할 만큼 극미량이 함유되어 있었는데, 전체적으로 무기성분 함량이 미미하여 원수특성을 감안하지 않고 배양액을 처방하였다.

Table 3.2. Characteristics and mineral nutrient contents of water used in experiment.

pH

EC
(dS·m^-1)

NH₄-N
(mM)

NO₃-N
(mM)

PO₄-P
(mM)

K
(mM)

Ca
(mM)

Mg
(mM)

SO₄(mM)

6.52

0.304

0.07

1.14

0.002

0.045

0.63

0.23

0.03

pH	EC (dS·m^-1)	NH₄-N (mM)	NO₃-N (mM)	PO₄-P (mM)	K (mM)	Ca (mM)	Mg (mM)	SO₄(mM)
6.52	0.304	0.07	1.14	0.002	0.045	0.63	0.23	0.03

재배기간 동안 플라스틱 하우스내 기상과 배양액의 pH, EC 수준을 매일 조사하였고, 양액의 무기성분은 시험 전과 시험 후 각각 조사하였으며 생육은 8월 23일 수확하여 최종 생육을 조사하였다.

상추의 수량은 젖힘 수확방법으로 5회 (2001년 7월 24일, 8월 3일, 8월 14일, 8월 29일, 9월 6일) 나누어 수확하여 조사하였으며, BSL 분석용 시료는 8월 25일에 채취하였다.

시험구는 완전임의배치 3반복으로 배치하여 각 구당 10주씩 생육 및 수량을 조사하였으며, BSL 분석은 각 구당 3개체의 상추 잎을 채취, 혼합 조제하여 분석하였다.

3.2.2. Bitter sesquiterpene lactones의 정량분석

상추 엽내 BSL 함량을 정량하기 위해, 상추 잎을 -80℃에서 냉동 후 동결건조기(일신 Freeze dryer)로 건조시킨 후 막자사발을 이용, 분쇄하여 분말 상태로 만든다음, 분말 시료 1 g을 메탄올 100 ml에 넣고 65℃에서 1시간 정도 환류시켰다. 메탄올 용액을 실온으로 냉각시킨 후 여과지를 이용해서 여과한 다음, 여과된 용액은 rotary evaporator로 30∼35℃를 유지시키며 1∼5 mmHg 압력상태로 감압 증류하였다. 메탄올 용액을 감압 증류하고 남은 잔사를 물에 녹여서 클로로포름(CH₃Cl)으로 2∼3회 추출하였다. 클로로포름 추출 용액을 황산마그네슘 (MgSO₄)으로 탈수한 다음, 온도를 20∼30℃를 유지시키며 1∼5 mmHg으로 감압 증류하였다. 감압증류하고 남은 잔사를 MeOH/CHCl₃(v/v=1/2) 용액에 녹여서 HPLC로 분리 정량하였다. 이때 HPLC 조건은 Table 3.3과 같다.

Table 3.3. Instrument and condition for identification and quantification of bitter sesquiterpene lactones in HPLC analysis.

Instrument
Column
Guard column
Mobile phase
Retention time
Flow rate
Detector

Dionex AD 25 Absorbance detector
Phenomenex Luna 5 μ C18(250×4.6 mm)
Phenomenex Security Guard (ODS Octadecyl, 4×3.0 mm)
H₂O/acetonitrile (90/10 = v/v) to 55/45 = v/v
30 min.
1 mL·min^-1
256 nm

Table 3.3. Instrument and condition for identification and quantification of bitter sesquiterpene lactones in HPLC analysis.
Instrument Column Guard column Mobile phase Retention time Flow rate Detector	Dionex AD 25 Absorbance detector Phenomenex Luna 5 μ C18(250×4.6 mm) Phenomenex Security Guard (ODS Octadecyl, 4×3.0 mm) H₂O/acetonitrile (90/10 = v/v) to 55/45 = v/v 30 min. 1 mL·min^-1 256 nm

이하 모든 실험의 BSL 분석은 이와 같았다.

3.2.3. 통계처리

실험의 결과에 대한 통계처리는 SAS 프로그램에 의해 분석하여 유의성을 검정하였다.

3.3. 식물기관 및 재배방법 차이에 따른 bitter sesquiterpene lactones 함량변화

3.3.1. 시험 재료 및 방법

수경재배 상추와 토양재배하는 상추의 BSL 함량과 식물체 기관별 함량을 비교 분석하고자 실험을 수행하였다.

실험에 이용된 품종은 '강한청치마'이며 2001년 6월 8일에 우레탄스펀지에 파종하여 3주간 양액육묘 후 6월 29일에 일반 토양재배는 비가림하우스에, 수경재배 상추는 유리온실 내의 담액수경재배 시스템에 각각 정식하였다.

수경재배에 이용된 양액은 3.2 여름철 수경재배 상추의 품종별 BSL 함량 실험에서와 같은 방법으로 수행하였다.

상추의 식물기관별 시료는 평균적인 생육을 보인 3개체를 임의 선정하여 개체별로 반복을 두어 시료를 채취 조제하였다. 하단부위 잎은 제15∼20엽위에서 2001년 9월 6일에 토양재배 상추와 수경재배 상추 잎을 채취하였고, 중단부위 잎과 화경 부위 잎은 토양재배 상추에서만 각각 제 25∼30엽위, 상단 제50∼55엽위에서 2001년 10월 12일에 채취하였다.

한편, latex는 같은 날 잎과 같은 위치의 중단 줄기와 화경 부위 줄기를 바늘로 상처 내어 乳細胞와 乳管에서 분비하는 latex를 채취하였다(Fig. 3.2).



Fig. 3.2. Plant parts of leafy lettuce for sampling. (Photographing : Oct. 12, 2001. Variety : Ganghancheongchima)

3.4. 차광재배에 따른 bitter sesquiterpene lactones의 함량관계

3.4.1. 시험 재료 및 방법

식물에서 동화산물의 생산은 광환경이 지대한 영향을 미친다. 따라서 광환경을 조절하기 위한 수단으로 무차광 재배한 대조구와 polypropylene 재질의 흑색차광망 규격 35%, 55%, 75%로 차광재배하여 BSL 함량을 비교하였다. 이 실험은 경기도농업기술원 (경기, 화성) 내에 설치된 길이 20 m, 폭 6 m, 높이 2.5 m의 플라스틱하우스 안의 담액수경재배 시스템 시설에서 수행하였다.

담액수경재배 시스템은 외형 크기가 L 85×W 40×H 35 cm로 베드부와 양액 탱크부가 일체식으로 된 수경재배기이며, 수경재배기의 배양액량은 베드부와 양액 탱크부를 합하여 50 L 용량이었다. 시험 품종은 '태풍여름적축면'이었으며, 2001년 7월 5일에 폴리우레탄 스펀지에 파종하여 Yamazaki 상추 전용 양액의 0.5배 농도로 20일간 육묘하여 7월 25일에 재식거리 15×8 cm로 처리 당 13개체를 정식하였다.

시험에 이용된 양액은 3.2 여름철 수경재배 상추의 품종별 BSL 함량실험에서와 같은 방법으로 수행하였다.

재배기간 동안 플라스틱 하우스내 기상과 재배 양액의 pH, EC 수준을 매일 조사하였고, 양액의 무기성분은 재배 전과 재배 후 각각 조사하였다.

최종 생육은 8월 23일 수확하여 조사하였는데, 처리별 식물체 반복으로 5개체를 조사하였으며, 차광재료의 광질 특성은 portable spectroradiometer (Li-cor, Li-1800)로 조사하였다.

3.5. 다량 ion 농도와 상추 bitter sesquiterpene lactones 함량관계

3.5.1. 시험 재료 및 방법

수경재배 배양액의 다량이온 중 N, P, Mg, S의 수준을 달리한 배양액이 상추 BSL 함량에 어떤 영향을 주는지 알아보고자 다량이온 N, P, Mg, S 에 대해 Table 3.4와 같이 처리하였으며, 미량원소는 각 처리 공히 Fe 35, B 18, Mn 3.6, Zn 0.3, Cu 0.2, Mo 0.1 μM로 하였다.

다량이온 처리 이외의 실험조건은 3.4 수경재배 상추의 차광재배효과와 BSL 함량의 관계 실험과 같은 시기, 같은 플라스틱하우스에서 이루어졌으며, 실험에 사용된 상추 품종과 육묘 및 수경재배 시스템도 동일하였다.

재배기간 동안 플라스틱하우스내 기상과 재배 양액의 pH, EC 수준을 매일 조사하였고, 양액의 무기성분은 시험 전·후를 조사하였다.

BSL 분석용 시료 채취 및 생육은 8월 23일 수확하여 조사하였다.

Table 3.4. Composition of nutrient solution at different ion concentration. (Unit : mM)

Factor

Strength

NO₃-N

NH₄-N

PO₄-P

K

Ca

Mg

SO₄-S

N

0.5
1^z)
3
5

3.0
6.0
12.0
18.0

0.25
0.5
1.0
1.5

0.25
0.5
1.0
1.5

2.0
4.0
8.0
12.0

0.5
1.0
2.0
3.0

0.5
0.5
0.5
0.5

0.5
0.5
0.5
0.5

PO₄-P

0.5
1
3

6.0
6.0
6.0

0.5
0.5
0.5

0.25
0.5
1.5

4.0
4.0
7.0

1.0
1.0
1.0

0.5
0.5
0.5

0.5
0.5
0.5

Mg

0.5
1
3
5

6.0
6.0
6.0
6.0

0.5
0.5
0.5
0.5

0.5
0.5
0.5
0.5

4.5
4.0
4.0
4.0

1.0
1.0
1.0
1.0

0.25
0.5
1.5
2.5

0.5
0.5
0.5
0.5

SO₄-S

0.5
1
3
5

6.5
6.0
6.0
6.0

0.5
0.5
0.5
0.5

0.5
0.5
0.5
0.5

4.0
4.0
6.0
8.0

1.0
1.0
1.0
1.0

0.5
0.5
0.5
0.5

0.25
0.5
1.5
2.5

^z) : The nutrient solution of Yamazaki's for lettuce.

^z) : The nutrient solution of Yamazaki's for lettuce.
Factor	Strength	NO₃-N	NH₄-N	PO₄-P	K	Ca	Mg	SO₄-S
N	0.5 1^z) 3 5	3.0 6.0 12.0 18.0	0.25 0.5 1.0 1.5	0.25 0.5 1.0 1.5	2.0 4.0 8.0 12.0	0.5 1.0 2.0 3.0	0.5 0.5 0.5 0.5	0.5 0.5 0.5 0.5
PO₄-P	0.5 1 3	6.0 6.0 6.0	0.5 0.5 0.5	0.25 0.5 1.5	4.0 4.0 7.0	1.0 1.0 1.0	0.5 0.5 0.5	0.5 0.5 0.5
Mg	0.5 1 3 5	6.0 6.0 6.0 6.0	0.5 0.5 0.5 0.5	0.5 0.5 0.5 0.5	4.5 4.0 4.0 4.0	1.0 1.0 1.0 1.0	0.25 0.5 1.5 2.5	0.5 0.5 0.5 0.5
SO₄-S	0.5 1 3 5	6.5 6.0 6.0 6.0	0.5 0.5 0.5 0.5	0.5 0.5 0.5 0.5	4.0 4.0 6.0 8.0	1.0 1.0 1.0 1.0	0.5 0.5 0.5 0.5	0.25 0.5 1.5 2.5

3.6. 전기전도도와 상추 bitter sesquiterpene lactones 함량의 관계

3.6.1. 시험 재료 및 방법

3.4 수경재배 상추의 차광재배효과와 BSL 함량의 관계 실험과 같은 시기, 같은 플라스틱하우스에서 이루어졌으며, 실험에 사용된 상추 품종과 육묘 및 수경재배 시스템도 동일하였다.

수경재배 상추에서 배양액의 전기전도도는 매우 중요한 근권 환경이다. 이러한 배양액의 전기전도도가 상추의 BSL 함량에 어떻게 영향을 끼치는지 알아보고자, Yamazaki 상추 전용액의 EC 수준을 0.5, 1, 2, 3 dS·m^-1등 4수준으로 조정하였으며, 이외의 실험조건과 조사 내용은 3.4 수경재배 상추의 차광재배 효과와 BSL 함량의 관계 실험과 같았다.

다음 4. 결과 및 고찰 가기